四、間歇滅菌方法

1、滅菌方法：

利用不加壓力的蒸氣滅菌，某些物質經高壓蒸氣滅菌容易破壞，可用此法滅菌。

（1）將欲滅菌物品置于鍋內，蓋上頂蓋，打開排水口，使器內余水排盡。

（2）關閉排水口，打開進氣門，根據需要消毒10~20min。

（3）滅菌完畢關閉進氣門，取出物品待冷至室溫溫度，放入37℃溫箱過夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可達到滅菌目的。

2、血清凝固器使用方法：

培養基中含有血清或雞蛋特殊成份時，因高熱會破壞其營養成份，故用低溫，可使血清凝固，又可達到滅菌目的：

（1）在使用該法滅菌的血清等分裝時，需嚴格遵守無菌操作，試管、平皿也經滅菌后使用；

（2）將培養基按要求使成斜面或高層，加足水后，接上電源，升溫75~90℃一小時后滅菌，放37℃溫箱過夜，再如此滅菌三次。

3、煮沸消毒：

可用煮鍋或煮沸消毒器，水沸騰后再煮5~15 min，也可在水中加入2%石炭酸煮沸5min，加入0.02%甲醛，80℃煮60min均可達到滅菌目的，但選用煮沸消毒的增消劑時，應注意對物品的腐蝕性。

4、滅菌處理：

滅菌后物品，按正常情況已屬無菌，從滅菌器中取出應仔細檢查放置，以免再度污染；

（1）物品取出，隨即檢查包裝的完整性，若有破壞或棉塞脫掉，不可作為無菌物品使用；

（2）取出的物品，如為包裝有明顯的水浸者，不可作為無菌物品使用；

（3）培養基或試劑等，應檢查是否符合達到滅菌后的色澤或狀態，未達到者應廢棄；

（4）啟閉式容器，在取出時應將篩孔關閉；

（5）取出的物品掉落在地或誤放不潔處,或沾有水液,均視為受到污染,不可作為無菌物品使用；

（6）取出的合格滅菌物品，應存放于貯藏室或防塵柜內，嚴禁與未滅菌物品混放；

（7）凡屬合格物品，應標有滅菌日期及有效期限；

（8）每批滅菌處理完成后，記錄滅菌品名、數量、溫度、時間、操作者。

五、有毒有菌污物處理要求

微生物實驗所用實驗器材、培養物等未經消毒處理，一律不得帶出實驗室。

1、經培養的污染材料及廢棄物應放在嚴密的容器或鐵絲筐內，并集中存放在指定地點，待統一進行高壓滅菌。

2、經微生物污染的培養物，必須經121℃，30min高壓滅菌。

3、染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液體不得低于浸泡的高度）再經121℃，30min高壓滅菌。

4、涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，烈性菌的沖洗液必須沖在燒杯中，經高壓滅菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗滌。做凝集試驗用的玻片或平皿，必須高壓滅菌后洗滌。

5、打碎的培養物，立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭干凈。

污染的工作服或進行烈性試驗所穿的工作服、帽、口罩等，應放入專用消毒袋內，經高壓滅菌后方能洗滌。

六、培養基制備要求

培養基制備的質量將直接影響微生物生長，因為，各種微生物對其營養要求不完全相同，培養目的的不同，各種培養基制備要求如下：

1、根據培養基配方的成分按量稱取，然后溶于蒸餾水中，在使用前對應用的試劑藥品應進行質量檢驗。

2、pH測定及調節：pH測定要在培養基冷至室溫時進行，因在熱或冷的情況下，其pH有一定差異，當測定好時，按計算量加入堿或酸混勻后，應再測試一次。培養基pH值一定要準確，否則會影響微生物的生長或影響結果的觀察。但需注意因高壓滅菌可影響一些培養基的pH降低或升高，故不宜滅菌壓力過高或次數太多，以免影響培養基的質量，指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等一般在調完pH后再加入。

3、培養基需保持澄清，便于觀察細菌的生長情況，培養基加熱煮沸后，可用脫脂棉花或絨布過濾，以除去沉淀物，必要時可用雞蛋白澄清處理，所用瓊脂條要預先洗凈晾干后使用，避免因瓊脂含雜質而影響透明度。

4、盛裝培養基不宜用鐵、銅等容器，使用洗凈的中性硬質玻璃容器為好。

5、培養基的滅菌既要達到完全滅菌目的，又要注意不因加熱而降低其營養價值，一般121℃，15min即可，如為含有不耐高熱物質的培養基如糖類、血清、明膠等，則應采用低溫滅菌或間歇法滅菌，一些不能加熱的試劑如亞碲酸鉀、卵黃、TTC、抗菌素等，待基礎瓊脂高壓滅菌后涼至50℃左右再加入；

6、每批培養基制備好后，應做無菌生長試驗及所檢菌株生長試驗。如果是生化培養基，使用標準菌株接種培養，觀察生化反應結果，應呈正常反應，培養基不應貯存過久，必要時可置4℃冰箱存放。

7、目前，各種干燥培養基較多，每批需用標準菌株進行生長試驗或生化反應觀察，各種培養基用相應菌株生長試驗良好后方可應用，新購進的或存放過久的干燥培養基，在配制時也應測pH，使用時需根據產品說明書用量和方法進行。

8、每批制備的培養基所用化學試劑、滅菌情況及菌株生長試驗結果、制作人員等應做好記錄，以備查詢。

七、樣品采集及處理要求

1、所采集的檢驗樣品一定要具有代表性，采樣時應首先對該批食品原料、加工、運輸、貯藏方法條件、周圍環境衛生狀況等進行詳細調查，檢查是否有污染源存在。

2、根據食品的種類及數量，采樣數量及方法應按標準檢驗方法的要求進行。

3、采樣應注意無菌操作，容器必須滅菌，避免環境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新潔爾滅、酒精等消毒藥物滅菌，更不能含有此類消毒藥物或抗生素類藥物，以避免殺死樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可應用。

4、樣品采集后應立即送往檢驗室進行檢驗，送檢過程中一般不超過3h，如，路程較遠，可保存在1~5℃環境中，如需冷凍者，則在凍存狀態下送檢。

5、檢驗室收到樣品后，進行登記（樣品名稱、送檢單位、數量、日期、編號等），觀察樣品的外觀，如果發現有下列情況之一者，可拒絕檢驗：

（1）樣品經過特殊高壓、煮沸或其他方法殺菌者，失去代表原食品檢驗意義者；

（2）瓶、袋裝食品已啟開者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失去原食品形狀者（食物中毒樣品除外）；

（3）按規定采樣數量不足者；

對送檢符合要求的樣品，檢驗室收到后，應立即進行檢驗，如果條件不具備，應置4℃冰箱存放，及時準備創造條件，然后進行檢驗。

6、樣品檢驗時，根據其不同性狀，進行適當處理。

（1）液體樣品接種時，應充分混合均勻，按量吸取進行接種。

（2）固體樣品，用滅菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225mL滅菌生理鹽水或其他溶液中，用均質器攪碎混勻后，按量吸取接種。

（3）瓶、袋裝食品應用滅菌操作啟開，根據性狀選擇上述方法處理后接種。

八、樣品檢驗、記錄和報告的要求

1、檢驗室收到樣品后，首先進行外觀檢驗，及時按照國家標準檢驗方法進行檢驗，檢驗過程中要認真、負責、嚴格進行無菌操作，避免環境中微生物污染。

2、樣品檢驗過程中所用方法、出現的現象和結果等均要用文字寫出試驗記錄，以作為對結果分析、判定的依據，記錄要求詳細、清楚、真實、客觀、不得涂改和偽造。